PCR儀反應(yīng)時(shí)dNTP和Mg2+充當(dāng)?shù)慕巧?/h1>

發(fā)布時(shí)間： 2021-12-23　　點(diǎn)擊次數(shù)： 2858次

 　　PCR儀采用熒光定量檢測(cè)技術(shù)可以對(duì)淋球菌、沙眼衣原體、解脲支原體、肝炎病毒、流感病毒和巨細(xì)胞病毒等病原體進(jìn)行定量測(cè)定。與傳統(tǒng)的檢測(cè)方法相比具有靈敏度高、取樣少、快速簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)。

　　PCR儀的反應(yīng)過程中dNTP和Mg2+充當(dāng)?shù)氖裁礃拥慕巧兀?/div>

　　脫氧核苷酸是DNA的基本組成元件，為DNA合成所必需。PCR中使用脫氧核苷酸通常是4種脫氧核苷酸的等摩爾混合物，即dATP（腺嘌呤脫氧核糖核苷三磷酸）、dGTP（鳥嘌呤脫氧核糖核苷三磷酸）、dCTP（胞嘧啶脫氧核糖核苷三磷酸）和dTTP（胸腺嘧啶脫氧核糖核苷三磷酸），通常統(tǒng)稱為dNTP。

　　PCR擴(kuò)增效率和dNTP的質(zhì)量與濃度有密切關(guān)系，dNTP干粉呈顆粒狀，如保存不當(dāng)易變性失去生物學(xué)活性。dNTP溶液呈酸性，使用時(shí)應(yīng)配成高濃度，以1mol/L NaOH或1mol/L Tris-HCl的緩沖液為宜，pH調(diào)節(jié)到7.0-7.5，小量分裝，-20℃冰凍保存。多次凍融會(huì)使dNTP降解。在PCR反應(yīng)中，dNTP的濃度應(yīng)為50-200μmol/L，尤其注意4種dNTP的濃度要相等（等物質(zhì)的量配制），如其中任何一種濃度不同于其他幾種時(shí)（偏高或偏低），就會(huì)增加錯(cuò)配概率。dNTP濃度過低又會(huì)降低PCR產(chǎn)物的產(chǎn)量。dNTP能與Mg2+結(jié)合，使游離的Mg2+濃度降低。

　　反應(yīng)體系中游離Mg2+的濃度對(duì)PCR反應(yīng)中耐熱DNA聚合酶的活性、PCR擴(kuò)增的特異性和PCR產(chǎn)物量有顯著的影響。反應(yīng)體系中Mg2+濃度低時(shí)，會(huì)降低Taq DNA聚合酶的催化活性，得不到足夠的PCR反應(yīng)產(chǎn)物；過高時(shí)，非特異性擴(kuò)增增強(qiáng)。此外，Mg2+濃度還影響引物的退火、模板與PCR產(chǎn)物的解鏈溫度、產(chǎn)物的特異性、引物二聚體的生成等。在標(biāo)準(zhǔn)的PCR反應(yīng)中，Mg2+的適宜濃度為1.5-2.0mmol/L。值得注意的是，由于PCR反應(yīng)體系中的DNA模板、引物和dNTP磷酸基團(tuán)均可與Mg2+結(jié)合從而降低游離Mg2+的實(shí)際濃度，因此，Mg2+的總量應(yīng)比dNTP的濃度高0.2-2.5mmol/L。如果可能的話，制備DNA模板時(shí)盡量不要引入大劑量的螯合劑（即EDTA）或負(fù)離子，因?yàn)樗鼈儠?huì)影響Mg2+的濃度。

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